Prélèvement et quantité d'échantillons

Pour les gels d'électrophorèse bidimensionnelle colorés au bleu de coomassie colloïdal ou à l'argent : l'épaisseur optimale des gels est de un millimètre et les spots découpés doivent être d'environ 2 mm3.

Pour l'analyse systématique des protéines d'un echantillon séparé par électrophorèse monodimensionelle, il est conseillé de découper tout les 1 à 2 mm dans la partie centrale de la piste (largeur de 1 à 2 mm).

Envoi des échantillons

Pour des séries tube eppendorf de 0.5 ml obligatoirement et rangés impérativement dans des boîtes annotées avec le nom du demandeur.

  • Les noms des spots doivent figurer sur le côté et sur le bouchon du tube (marqueur fin indélébile). Ne pas utiliser une nomenclature complexe ; l'idéal étant d'annoter les tubes avec un numéro croissant
  • Pour des séries supérieurs à 10 échantillons :

    • La plateforme vous fera parvenir des plaques de 96 puits spécifiques (Les plaques sont percées pour être directement utilisées par le robot de digestion)
    • Laisser les deux premiers puits vides. Ils sont utilisées pour vérifier le bon fonctionnement de la digestion automatique
    • Remplissez le tableau de microplaque et faites-le parvenir par mail

    Coloration des gels à l'argent

    Il est possible de colorer les gels à l'argent mais à condition de ne pas utiliser de glutaraldéhyde. (protocole)

    La décoloration des spots apporte une amélioration si elle est effectuée rapidement après la coloration (moins d'un jour)

    Il existe des protocoles de coloration à l'argent modifiés pour la spectrométrie de masse :

    Contaminations

    Bien que les contaminations avec de la kératine ne comportent pas un problème majeur en LC-MS/MS (contrairement aux analyses MALDI-TOF), voici quelques précautions pour limiter leur présence et ainsi augmenter la sensibilité de l'analyse :

    • Utilisation de solutions tampons fraîchement préparées et réservées aux électrophorèses
    • Utilisation de gants (sans poudre ou lavés au Teepol) pendant toute la durée de la manipulation afin d'éviter toutes traces de kératine et de protéases sur les doigts et les gants.

    Pour les échantillons liquides, les sels doivent être en concentration inférieure à 0,1M.

    Détergent et suppression de signal en ESI
    Sodium dodecylsulfate (SDS)10 %
    Sodium taurocholate10 %
    Sodium cholate21-30 %
    CTAB10 %
    LDAO10 %
    CHAPS31-60 %
    Tween2010-20 %
    Thesit10 %
    Triton X10010 %
    NP4010 %
    n-octyl sucrose10-20 %
    n-dodecyl sucrose10-20 %
    n-dodecyl maltoside21-30 %
    octyl glucoside21-30 %
    octyl thioglucoside21-30 %
    n-hexyl glucoside30-60 %
    n-dodecyl glucoside60%

    Ogorzalek Loo R.R.,. Protein Science 3: 1975 (1944)